Хлорелла. Выращивание в биореакторе на подоконнике.

Теория.

Хлорелла (Chlorella vulgaris ) - зеленая одноклеточная водоросль, которой приписывают массу чудодейственных свойств, большинство из которых, однако, не соответствуют действительности или не имеют научного подтверждения на практике. Среди оставшихся есть одно, которое весьма ценно для аквариумистов. Хлорелла - отличный корм для планктона.

Chlorella vulgaris имеет размер 2 - 10 микрон. Благодаря такому крохотному размеру ею можно кормить не только моину, но и инфузорий туфелек.

Размножается хлорелла делением, но в отличие от инфузорий или бактерий, она не просто делится на двое, а может быстро и последовательно делиться внутри себя на 2, потом на 4, затем на 8, 16 и вплоть до 32 частей, после чего оболочка лопается и на свет выходит целый выводок маленьких хлорелл. Кстати сказать, оболочка не просто лопается, а фактически съедается малышами как стартовый корм,  демонстрируя нам очень эффективное отношение к питательным ресурсам (Ru et al., 2020; Yamamoto et al., 2014).

Хлорелла дает быстрый прирост питательной и полезной биомассы и при этом не требует огромных земельных участков. Да что там участков - в банке на подоконнике ее можно вырастить в большом количестве на копеечном удобрении. Ее даже всерьез рассматривают как питание колонистов на других планетах, когда они туда, наконец, прилетят. 

Итак, для выращивания хлореллы нужны вода, еда и свет. Еда - это углекислый газ, макро и микро элементы. Макроэлементы - NPK - азот, фосфор и калий. Это основа питания. В качестве источника NPK лучше всего использовать нитрофоску - дешево и сердито. 

В меньшем количестве хлорелле нужны магний, сера и кальций. И в микродозах железо, марганец, бор.

Сера попадет в воду вместе с нитрофоской, где она присутствует в виде примесей - сульфата кальция (гипс), сульфата аммония и (или) сульфата калия. Этих примесей хлорелле с лихвой хватает.

Магния в нитрофоске либо мало, либо вовсе нет, зато он должен быть в водопроводной воде, если она имеет магниевую жесткость. Если не имеет - это проблема. Хлорелла может плохо расти и иметь бледный вид. Тогда надо добавлять магний руками. Купить в аптеке или садовом магазине сульфат магния (магнезию) и добавлять в питательную среду буквально на кончике ножа (около 0.1–0.2 грамма на литр). 

Кальций в достаточных количествах присутствует практически в любой водопроводной воде. Воду не надо кипятить, так как кальций при кипячении выпадает в осадок. Дистиллированная вода не подходит. Также не подходят талая и дождевая вода в чистом виде.

Так как железо нужно в микродозах, то его в основном всегда хватает, как в водопроводной воде, так и в самой нитрофоске, которую никто не очищает до чистого лабораторного состояния. Однако если в нашей банке хлорелла будет развиваться быстро и бурно, то она сможет выесть все железо, пожелтеть и перестать расти. В этом случае можно добавить крохотное количество хелата железа (микроудобрение из садового магазина).

Марганец и бор нужны хлорелле в исчезающе малых количествах, поэтому она по любому  отыщет их в банке с водопроводной водой и нитрофоской.

Гораздо большей проблемой является обеспечение хлореллы светом и углекислым газом. Если в средней полосе летом на подоконнике света будет достаточно, то зимой, осенью и весной - будет не хватать. Хлорелла любит длинный световой день. 

В своей работе "Optimal growth conditions to enhance Chlorella vulgaris biomass production in indoor phyto tank and quality assessment of feed and culture stock" ученые проводили опыты над хлореллой чтобы понять при каком фотопериоде хлорелла растет лучше всего. Оказалось, что наибольшую плотность клеток хлореллы дает фотопериод 16:8 (16 часов света и 8 часов темноты). Самый неэффективный режим - 8:16 (8 часов света и 16 часов темноты).

В научной работе «Optimization of light intensity and color temperature in the cultivation of Chlorella vulgaris culture using the Surface Response Method» исследователи определили идеальную цветовую температуру для роста хлореллы - 4150 К (нейтральный/естественный белый).

Что касается мощности источника света, то рекомендуется придерживаться правила примерно 3–5 Ватт LED-мощности на 1 литр объема культуры. Следовательно на 5 литровую бутыль нужна лампа 15 - 20 Ватт.

Есть также исследования, которые выявили, что слишком яркий свет угнетает рост хлореллы. В работе "Effect of Light Intensity and Quality on Growth Rate and Composition of Chlorella vulgaris" описывается эксперимент, в котором хлорелла выращивалась под разными источниками света, в том числе и искусственными. Как и ожидалось, интенсивность света оказалась одним из важнейших параметров культивирования микроводорослей и производства биомассы.

Наиболее существенный рост хлореллы наблюдался при интенсивности света  6 000 – 6 400 люкс. Для пятилитровой баклажки это светодиодная лампочка примерно 16 - 18 Вт.

При интенсивности света 3 750 – 4 000 люкс хлорелла выживала, но размножалась медленно. Это светодиодная лампа примерно 11 - 13 Вт .

При интенсивности света 8 250 – 8 800 люкс хлорелле поплохело. Свет такой интенсивности вызывал фотоингибирование (подавление роста светом). Для светодиодных ламп и пятилитровой баклажки  это будет примерно 22–25 Вт.

Это следует принимать во внимание, когда выращиваем хлореллу в банке на подоконнике. У меня на юго-восточной стороне хлорелла на подоконнике выпадала в осадок под ярким июльским солнцем. А когда еще и перегревалась, то быстро протухала вообще.

И еще интересный факт: когда хлорелла растет в условиях недостаточной освещенности, то всякое усиление света дает пропорциональный прирост водоросли. Однако когда интенсивность света достигнет некоторого порогового значения, как, например, 6 000 – 6 400 люкс в исследовании выше, то увеличение интенсивности света больше не дает никакого прироста.

Итог по свету: если хотим выращивать хлореллу не только летом, то покупаем светодиодную лампу. Если стремимся к идеалу, то, вооружившись научными данными, покупаем светодиодную лампу с маркировкой 4000 К (на коробках пишут «Нейтральный белый свет» или «Естественный белый») и мощностью достаточной для объема культуры согласно эмпирическому правилу, приведенному выше.

Справедливости ради надо сказать, что хлорелла может расти и в полной темноте. Если выключить свет, но добавить в воду органический углерод (например, глюкозу или ацетат), хлорелла не погибнет. Она «выключает» фотосинтез, частично растворяет свой зеленый хлорофилл и начинает питаться как обычные дрожжи или грибы — просто поглощает сахар из раствора.

А вот еще интереснее: если добавить сахар и оставить свет, то включится "турбо" режим. Скорость размножения хлореллы увеличивается в разы. Почему же мы не слышим радостных докладов от аквариумистов, которые получили концентрат хлореллы за считанные часы? Проблема в том, что сахар любят все. И бактерии, и дрожжи, и прочие организмы. Многие из них размножаются гораздо быстрее хлореллы. Через несколько дней вы скорее всего получите отвратительно пахнущий бульон вместо хлореллы. Такой турбо режим доступен только в специальных лабораториях, где поддерживается идеальная стерильность, доступны идеально чистые маточные культуры хлореллы, возможно применяются антибиотики.

Вторая проблема - углекислый газ. 

Если мы обеспечили хлореллу мощным светом и нитрофоской, то углекислый газ становится главным лимитирующим фактором. Согласно закону ограничивающего фактора (Закон Минимума Либиха) скорость роста популяции определяется тем элементом, который находится в дефиците. 

Даже если в банке полно нитрофоски и все 24 часа она освещается мощным светом цветовой температуры 4150 К. Без углекислого газа хлорелла расти не будет.

Сухая масса хлореллы более чем на 45–50% состоит из чистого углерода. Единственный источник этого углерода для неё — молекула CO2. В условиях обычной нашей комнаты хлорелла съест весь растворенный CO2 за первые несколько часов активного фотосинтеза. Далее хоть освещай, хоть не освещай, хоть корми нитрофоской, хоть не корми, рост хлореллы остановится.

Как вообще CO2 попадает в банку с хлореллой. Из трех источников: из воздуха, из исходной водопроводной воды и от дыхания разных водных организмов (бактерий, простейших, грибов и дрожжей) которые неизбежно проникают в незакрытый сосуд.

Основным источником из перечисленных является атмосферный воздух в котором содержится около 0,04% углекислого газа. Концентрации газа в воде и воздухе всегда стремятся прийти к равновесию. Количество CO2, растворенного в воде, подчиняется закону Генри, который связывает концентрацию газа в жидкости с его давлением в атмосфере. И это количество в воде всегда меньше, чем в воздухе. Причем чем выше температура воды, тем его в воде меньше.

В общем CO2 хлорелле всегда не хватает. Что делать? Можно ничего не делать. Углекислый газ будет потихоньку проникать в банку из воздуха, хлорелла будет расти, хоть и не с максимальной скоростью, но будет. Она не будет такой насыщенной как банка с зеленой краской, но для нужд аквариумиста вполне может хватить и этого. К тому же хлорелла относится к водорослям, которые умеют извлекать CO2 из карбонатной жесткости воды.

Если хочется немного большего, то можно включить аэрацию. Перемешиваясь, углекислый газ будет распределяться в банке равномерно, а не только в тонком верхнем слое воды.

Можно периодически дуть в банку через трубочку. Человек выдыхает около 4% углекислого газа (это в 100 раз больше, чем в воздухе). Несколько глубоких выдохов через длинную соломинку прямо на дно банки дадут хлорелле мощный заряд питания на весь день.

Поставить бульбулятор на дрожжах или лимонке.

Или, если стремимся к идеалу, оснастить емкость системой подачи CO2 из баллона. Но тут надо быть осторожным, чтобы не переборщить. Подача чистого, 100% CO2 в небольшой объем может обрушить pH и убить хлореллу.

В промышленном производстве хлореллы автоматика мониторит уровень CO2 в питательной среде и впрыскивает его по мере необходимости.

Для наших скромных целей вряд ли целесообразно будет заморачиваться автоматикой. Можно просто начать с малого, скажем с подачи 1 пузырька в 3 секунды и только на свету. Потом подкорректировать если что.

Температура.

Оптимальная температура для выращивания хлореллы находится в диапазоне 25 - 30 °C.

От холода хлорелла практически не гибнет. При температуре +15...+16 °C метаболизм резко замедляется. Клетка переходит в режим энергосбережения, деление практически останавливается, падает уровень хлорофилла. В жидкой воде вообще хлорелла не гибнет. После потепления пробуждается и растет себе дальше. Вот если вода замерзнет совсем, тогда кристаллы льда просто разорвут клетки хлореллы и она погибнет.

При температуре выше 32 °C хлорелла получает тепловой стресс. После 35 °C деление клеток прекращается. Но хлорелла не умирает при такой температуре.

Если температура 38 - 40 °C, тогда начинается гибель клеток. Скорость гибели резко увеличивается при увеличении температуры в этом диапазоне. Температура выше +42 °C является абсолютно летальной для стандартных штаммов Chlorella vulgaris.

На подоконнике, на южной стороне, под прямыми солнечными лучами в банке с хлореллой запросто может подняться температура до +42 °C.

Сколько сыпать в граммах.

Так как хлореллу мы, аквариумисты, в основном выращиваем не на продажу и даже не для красоты, а для скармливания другим полезным обитателям, таким как коловратки, инфузории, моины и дафнии, то с концентрацией удобрения надо быть осторожными. Вот пошаговый рецепт:

1. Растворяем 1г нитрофоски в 1 л чистой воды.
2. Даем отстояться. На дно может выпасть осадок, представляющий собой взвесь нерастворенного гипса и прочий мусор. 
3. Аккуратно сливаем прозрачную верхнюю воду или процеживаем её через плотную ткань/ватный диск, чтобы мусор не попал в культуру.
4. Добавляем полученный прозрачный раствор в емкость с хлореллой из расчета 20–30 мл концентрата на 1 литр воды. На пятилитровую баклажку это 100 - 150 мл.

После первичного залива больше не льем до созревания культуры. Созревание определяется насыщенным зеленым цветом. При достаточном свете обычно это занимает 7 - 10 дней. 

Далее мы скорее всего отбираем часть культуры для кормления. Например 1 - 2 литра. Взамен доливаем чистую воду.  Вносим раствор нитрофоски в количестве 20–30 мл концентрата на каждый литр воды в банке. Например, было 5л, отобрали 2л. Долили два литра чистой воды. Внесли 100 - 150 мл концентрата нитрофоски на 5 литров культуры.

При таком способе культивирования вероятна ситуация, когда хлорелла не успевает съедать всю нитрофоску, и после каждого отбора и долива концентрация удобрения немного повышается. В конце концов может возникнуть передоз. Поэтому имеет смысл время от времени сливать большой объем, скажем 90 %, чтобы снизить риск передозировки.

Стоит добавить, что рекомендация заливать 20–30 мл концентрата на 1 литр воды при старте культуры, относится к чистой лабораторной или пищевой культуре хлореллы. Обычно такая культура стоит дорого и не используется аквариумистами.  Аквариумисты чаще покупают продукт, который выпускается как готовое удобрение для садовых растений. И тут нужно учесть нюанс: внутри бутылки помимо самой культуры хлореллы скорее всего есть питательная среда. Если залить к ней еще нитрофоски в объеме 20–30 мл на 1 литр воды, то будет перебор и риск гибели культуры. В этом случае стоит уменьшить первоначальную вносимую дозу нитрофоски в два раза.

Как хранить.

Если необходимости в кормлении живности хлореллой на данный момент нет, то сливать часть культуры все равно нужно. Иначе хлорелла отравит себя собственными продуктами жизнедеятельности. Также скорее всего закончится железо или другие микроэлементы и культура погибнет. В общем, если постоянно не заботиться о ней, культура в любом случае погибнет. 

Чтобы поддерживать культуру в хорошем состоянии нужно раз в 7–10 дней сливать половину банки (2.5 литра). Слитую воду можно просто вылить в унитаз или полить ею комнатные цветы (для них это шикарное удобрение). Затем долить чистую воду и внести нитрофоску. Так культура будет жить месяцами. 

Почему не годами? Потому что культура все равно за длительное время накопит вредные продукты жизнедеятельности и отравит себя. В культуру обязательно проникнут другие водоросли, бактерии, грибы и прочие вредители, которые будут конкурировать с хлореллой и угнетать ее рост. То есть бесконечно растить хлореллу из одной купленной баночки с культурой не получится. Через некоторое время все равно надо будет покупать новую культуру и начинать сначала.

Если уезжаете в отпуск, банку можно поставить в холодильник. В темноте и холоде (+4...+10 °C) хлорелла может стоять без ухода до месяца. Потом её достаточно снова выставить под свет, и она оживет.

Излишки хлореллы можно морозить в формочках. Она погибнет, конечно, но сохранит питательные вещества. Зеленые кубики льда можно затем бросать в емкости с моиной, например.

Питательная ценность.

Питательная ценность хлореллы довольно высока, если сравнивать ее с традиционными кормовыми наземными растениями, типа люцерны, клевера, салата. В ее составе нет таких "несъедобных" компонентов, как древесина, солома или жесткие волокна как у наземных растений. Почти 85–90% сухой массы клетки хлореллы — это чистые питательные вещества (белки, доступные углеводы, липиды и витамины). По этому показателю она превосходит любую наземную зеленую массу (люцерну, клевер, салат) в 4–5 раз.

В среднем, при выращивании хлореллы на сбалансированной питательной среде (нитрофоске и CO2), ее сухая биомасса содержит:

• Белок: 50 - 55%. Довольно высокий показатель. К тому же белок хлореллы весьма качественный - он содержит все 10 незаменимых аминокислот (включая лизин, лейцин и триптофан), которые организм рачков и рыб не может синтезировать сам.
• Углеводы: 15 - 20%. Это тоже довольно много. Для кормления дафнии моины, например, это очень хорошо, потому что дафнии находятся в постоянном движении, и расходуют много энергии фильтруя воду. Углеводы - топливо для этого процесса. Многие аквариумные рыбы плохо усваивают углеводы и дафния, нашпигованная таким количеством углеводов, вряд ли пошла бы им на пользу, но так как дафния тратит их на энергию и производство жиров, то малек получает в виде дафнии уже хорошо сбалансированный корм.
• Жиры (Липиды): 10–15%.
• Минералы (Зола): 5–10%.
• Провитамин А (Бета-каротин). 

Хотя белок хлореллы и содержит все 10 незаменимых для рыб аминокислот, по одной из них - метионину есть существенная просадка. Метионина в белке хлореллы меньше, чем потребность в нем у мальков многих аквариумных рыб. 

Практика.

Вот схема простого, но весьма эффективного биореактора для выращивания хлореллы:

Всего 4 компонента: 

1. Пятилитровая бутылка.
2. Компрессор.
3. Термометр.
4. Настольная лампа.

Компрессор не только насыщает воду углекислым газом, но и перемешивает культуру. Без этого она быстро расслоится. Сверху будет почти прозрачная, внизу темнее, а на дне зеленый осадок. К тому же при постоянном перемешивании гарантируется, что каждая клетка хлореллы получит одинаковое количество света.

Термометр крайне желателен, если биореактор стоит на подоконнике и есть риск перегрева. 

Настольная лампа соответствующей мощности продлит световой день.

Литература:

1. Safi C. et al. "Influence of microalgae cell wall characteristics on protein extractability and determination of protein content using different methods", Journal of Applied Phycology, 2014.

2. "Chlorella vulgaris as a food substitute: Applications and benefits in the food industry". Chiao-An Wang, Helen Onyeaka, Taghi Miri Fakhteh Soltani. 2024.